Kultura biljnog tkiva kanabisa: Što je to?

• 1. Povijest kulture tkiva
• 2. Osnove kulture tkiva
• 3. Što je kultura biljnog tkiva i kako funkcionira?
• 4. Kultura tkiva vs kloniranje
• 4. a. Kloniranje
• 4. b. Kultura biljnog tkiva
• 5. 5 koraka kulture tkiva
• 5. a. Kultura biljnog tkiva kod kuće
• 5. b. Vodič za kemijski sastav
• 6. Zaključak

Kultura tkiva podrazumijeva uzimanje živog biljnog tkiva iz biljke i uzgoj tog tkiva u cijelu biljku u sterilnim uvjetima. Ovaj proces seže još iz 1885. godine i relativno je nov kada govorimo o sjemenkama kanabisa, ali je izuzetno učinkovit i može se koristiti za većinu biljnih vrsta. Proces kulture tkiva rezultira stabiliziranim izvorom biljnih stanica koje tehničari mogu očuvati množenjem biljnih stanica. Čuvanjem ovog germplazma u čistim i sigurnim prostorima omogućuje se očuvanje i stalna propagacija određenih biljnih sorti i fenotipova. Ova tehnika u konačnici pomaže očuvanju rijetkih biljaka ili održavanju produktivnih i snažnih fenotipova živima za daljnju upotrebu na terenu nakon razmnožavanja. Kulturu tkiva možete zamisliti kao "banke" genetike koje se čuvaju u posebnim uvjetima dok ne bude potrebe za presađivanjem u posude ili na otvoreno.

1. Povijest kulture tkiva

Povijest kulture tkiva seže u 1885. godinu kada je jedan njemački zoolog pokušao uzgojiti tkivo iz embrija pilića, ali tek je 1907. godine američki zoolog uspješno uzgojio živčanu stanicu žabe.

Kasnije, 1910. godine, francuski kirurg je unaprijedio ovu tehniku i definirao što kultura tkiva jest. Kad je tehnika definirana i uspostavljena, niz drugih eksperimenata je uspjelo te su znanstvenici uspjeli uzgojiti matične stanice u umjetnim uvjetima, što je dovelo do napretka u razumijevanju ljudske biologije i regenerativne medicine. No, možda se pitate kakve to veze ima s kanabisom?

2. Osnove kulture tkiva

Prije nego što dublje zaronimo u kulturu tkiva, njezin rad i razlike između kulture tkiva i kloniranja, upoznajmo osnove kulture tkiva.

Istraživanje

Ako želite kod kuće isprobati kulturu tkiva, prvo što trebate učiniti je istražiti je li netko to uspješno radio s tom specifičnom genetikom kako biste slijedili isti postupak i možda koristili to kao smjernicu za što treba ili ne treba raditi.

Biljno tkivo

Sada kada znate što trebate slijediti, iduće što trebate je pronaći biljku koju ćete koristiti za proces kulture tkiva. Donorska biljka mora biti 100 % zdrava i bez bolesti. Također, dio biljke koji koristite razlikuje se od biljke do biljke, stoga svakako slijedite prethodno spomenute smjernice za veće šanse uspjeha. Imajte na umu da ovaj proces ovisi o čistom okolišu pa pazite da je sve čisto i sterilizirano, uključujući vašu odjeću, materijal i samu prostoriju jer je kontaminacija najčešći razlog neuspjeha.

Zrak

Sljedeći je zrak jer biljkama treba čist zrak. Kako biste osigurali čisti zrak, možete kupiti ili izraditi improviziranu kutiju s rukavicama, npr. od starog akvarija i PVC cijevi.

Medij

Jedan od najvažnijih dijelova kulture tkiva je medij, mjesto gdje će biljka biti kada dovoljno naraste. Medij treba biti želatinozna tvar koja daje stabilnost i podršku razvoju korijena i rastu biljke te hranjive tvari potrebne da biljka dobije energiju za rast, zbog čega je jedan od najpopularnijih medija Agar.

Sada kada imate bolju ideju što vam treba, nastavite čitati kako biste saznali kako kultivirati kanabis i ostale biljke putem kulture tkiva. Zapamtite da kultura tkiva može biti zahtjevna ako nemate odgovarajući materijal i opremu, ali nema razloga za brigu. Uvijek možete klonirati svoje biljke; Iako količina klonova ovisi o broju grana na biljci, to je puno jednostavnije i ne zahtijeva previše iskustva. Potrebni su vam samo gel za kloniranje i škare, i to je to!

3. Što je kultura biljnog tkiva i kako funkcionira? 

Kultura tkiva je upravo ono što je gore objašnjeno – dakle, uzmete nekoliko dijelova biljnog tkiva ili stanica i razvijete stotine ili čak tisuće identičnih klonova iz tog materijala. Ova metoda omogućuje uzgajivačima da određenu genetiku sačuvaju gotovo zauvijek, uz minimalno prostora i truda. Kao i kod klasičnog kloniranja, kultura tkiva započinje uzimanjem malog dijela biljke koju želite klonirati, ali za razliku od klasičnog kloniranja, ovaj uzorak tkiva se prereže, sterilizira i nakon čišćenja stavlja se u hranjivi medij koji sadrži ne samo hranjive tvari, već i hormone i šećere.

Ovaj hranjivi medij ovisi o svakom uzorku jer određene hranjive tvari i hormoni pokreću određene faze razvoja, pa ako želite potaknuti rast, razvoj korijena ili umnožavanje (kada je biljka dovoljno velika), morate koristiti poseban medij za željeni razvoj. Dakle, uz mali dio tkiva, kada ono naraste dovoljno, može se podijeliti na stotine dijelova za pojedinačno kloniranje, ako to želite. Kada ta tkiva narastu, dobivaju hranjivi medij koji potiče ukorjenjivanje i zatim rast.

4. Kultura tkiva vs kloniranje

Kako se industrija kanabisa razvija, komercijalni uzgajivači traže načine za veće prinose i jaču snagu u kraćem vremenu. Kada je moguće, uzgajivači prelaze s kloniranja na kulturu tkiva, ali zašto?

Kloniranje 

Kao što možda već znate, kloniranje podrazumijeva uzimanje reznica s biljke i čekanje dok ne razviju korijen kako bi ih uzgojili. Taj klon će postati identična kopija svoje matične biljke.

Ali klonovi mogu biti nepouzdani kao i sadnice, jer je teško postići visoku stopu preživljavanja. Također su podložni štetnicima, infekcijama, bolestima, i kako generacije prolaze, veća je mogućnost genetskih mutacija. Kod kulture tkiva, situacija je bitno drugačija.

Kultura biljnog tkiva

Proces kulture tkiva je relativno jednostavan ali traži puno kontrole za održavanje optimalnih uvjeta. Laboratoriji za kulturu tkiva zahtijevaju:

Sterilizacija

Kulture tkiva zahtijevaju idealan okoliš za rast biljaka, pa taj okoliš treba pružati sve što biljka treba u lako dostupnom obliku. No, taj okoliš pogodan je i za bakterije i štetne mikroorganizme, stoga je sve potrebno sterilizirati. Sterilizacija je presudna jer plijesni ili bakterije mogu uništiti biljke – zato ne samo laboratorij, već i alati, oprema i biljno tkivo (ili “eksplantat”) trebaju biti sterilizirani.

Aseptički okoliš  

Ključno je cijeli proces provoditi u potpuno sterilnom okruženju pa se, u idealnim uvjetima, koristi posebna komora u kojoj dodirujete već sterilnu opremu. Ova posebna okolina koristi se svaki put kad trebate izložiti bilo što, poput alata, opreme ili tkiva zraku.

Bolesti lako ulaze u radni prostor; spore gljivica stalno su oko nas u zraku. Kako bi se spriječila kontaminacija in vitro biljaka (onih koje rastu u staklu, poput Petrijevih zdjelica), tehničari često rade ispred ili pod radnom napom (flow hood). Takvi uređaji koriste ventilatore za propuštanje zraka kroz HEPA filter — uredaj sposoban filtrirati i najmanje nečistoće iz zraka poput virusa, bakterija i spora gljivica. Čist zrak zatim struji preko radnog prostora u laminarnom toku, čime čestice ne dospijevaju na otvorene zdjelice.

Poseban medij za uzgoj

Uz kulturu biljnog tkiva, sterilni medij daje biljci hranjive tvari, šećer, vodu i mjesto za rast — u njemu biljke imaju sve za preživljavanje dok se ne oblikuju u cijelu biljku. Medij možete napraviti i kod kuće, koristeći gotov prašak, šećer i destiliranu vodu s pH namještenim na 5,8. Iako je relativno jednostavno, potrebno je puno mjera opreza.

5. 5 koraka kulture tkiva

Ovo je 5 jednostavnih koraka kulture biljnog tkiva u laboratoriju — imajte na umu da je ovo sažetak cijelog procesa.

1. Odaberite biljku koju ćete koristiti;
2. Stavite tkivo u sterilno okruženje, uklonite komadić, očistite ga i pustite da raste u odgovarajućem mediju;
3. Osigurajte odgovarajuće uvjete i pustite tkivo da se umnoži (obično traje 14 dana);
4. Poticati razvoj korijena biljke;
5. Presadite u konačnu posudu i pustite da raste.

Ako želite detaljnije upute i kako napraviti kod kuće, evo vodiča – imajte na umu da su vam potrebni skupi alati pa, iako je DIY, trebat ćete posebnu opremu.

Kultura biljnog tkiva kod kuće

Ako vas zanima vodič kako napraviti kulturu biljnog tkiva s kanabisom, evo detaljnog korak-po-korak vodiča – kao što smo rekli, bit će vam potrebna posebna oprema, ali potpuno je moguće izvesti i kod kuće.

Faza inicijacije (1-2 tjedna)

Korak 1

Upalite radnu napu i pustite da radi najmanje 30 minuta prije početka; ako nemate laminarni ormar, koristite alkoholni plamenik ili lampu i radite blizu plamena.

Korak 2

Sterilizirajte radnu napu s 70% etanolom ali ga ne prskajte ravno na filter.

Korak 3

Uključite svoj sterilizator i pustite ga da se zagrije 20 minuta.

Korak 4

Sterilizirajte paket papira u suhom ciklusu, zatim sterilizirajte posude, vodu i tween u sporom ciklusu.

Korak 5

Za pripremu medija uzmite posudu, napunite je vodom reverzne osmoze, destiliranom ili deioniziranom vodom (idealno). Ako radite 1 L medija, dodajte 900 ml vode. Kada je voda spremna, dodajte Grow hranjiva do EC vrijednosti 1,5, zatim dodajte 30 g/L šećera i podesite pH otopine na 5,7, zatim dodajte 6 g/L agara te sve prebacite u bocu pogodnu za sterilizaciju, ali nemojte je prepuniti. Sterilizirajte bocu 15 min, zatim nalijte oko 50 ml u svaku steriliziranu posudu.

Korak 6

Kada imate spreman medij, napravite otopinu s 0,5% izbjeljivača i 0,1% sterilnog tweena 20; ako imate samo 2,75% izbjeljivača, dodajte 181 ml na 1 L.

Korak 7

Napunite posudu s malo vode, uzmite svoj kanabis materijal i stavite ga u vodu, obavezno neka biljni materijal bude zdrav. Ako ga držite duže od sat vremena, stavite ga u rashlađivač s ledom i pokušajte ga što prije staviti u vodu.

Korak 8

Uzmite hermetički zatvorivu steriliziranu posudu i napunite je otprilike 80% otopinom izbjeljivača/tweena, dodajte biljni materijal i zatvorite.

Korak 9

Nježno tresite 20 minuta, a potom prodrmajte snažno 20 sekundi nakon početnih 20 minuta.

Korak 10

Prebacite biljni materijal u drugu posudu napunjenu s 80% sterilne vode, nježno tresite 5 minuta i ponovite još 2 puta.

Korak 11

Koristite sterilne pincete za prijenos biljnog materijala na sterilni papir kako biste upili višak vode, zatim stavite po jedan komad u svaku posudu. Biljka treba biti u uspravnom položaju u posudi i stavite na policu na 25°C pod svjetlom u 18/6 ciklusu najmanje 3 tjedna. Kada su biljke spremne, uspješno ste uzgojili klon i sada ga možete presaditi u medij po želji, na otvorenom ili u zatvorenom.

Vodič za kemijski sastav 

Imate na umu da postoji više vrsta medija, minerali i količina ovise o vrsti koju koristite, a ovaj vodič pisan je prema Murashige-Skoog mediju kao primjer pa svakako provjerite koje su preporučene komponente i količine za vaš medij.

Ovo su esencijalni nutrijenti koje vaše biljke kanabisa trebaju u velikim količinama i ključni su za kulturu tkiva, bez njih biljke neće moći razviti zelenu masu.

Ovo su nutrijenti kanabisa koji biljkama trebaju u manjim količinama ali su također ključni u kulturi tkiva, bez njih biljke neće rasti kako treba i pokazat će simptome nedostatka.

Ovi vitamini nužno pomažu metabolizmu vaše biljke, posebno kod kulture tkiva, pa imajte na umu da ih pružite u odgovarajućoj količini.

6. Zaključak

Kultura tkiva kanabisa može izgledati dosta zahtjevno, ali zapravo je relativno jednostavno, samo morate osigurati najbolje uvjete i poduzeti sve sigurnosne mjere kako biste postigli najveću stopu preživljavanja. Znamo da je ova tehnika relativno nova i može biti dosta skupa, pa možda svi uzgajivači nemaju pristup potrebnoj opremi, ali ako radite ili ste napravili vlastiti laboratorij za kulturu tkiva kod kuće, svakako podijelite svoja znanja s kolegama uzgajivačima – ostavite komentar ispod!

Vanjske reference

1. Plant Tissue Cultures. - Kärkönen, Anna & Santanen, Arja & Iwamoto, Kuninori & Fukuda, Hiroo. (2020). 
2. Nanotechnology and Plant Tissue Culture. - Tariq, Amina & Ilyas, Saiqa & Naz, Shagufta. (2020). 
3. Plant Tissue Culture Media, Recent Advances in Plant in vitro Culture. - Annarita Leva i Laura M. R. Rinaldi (2012).