Tkivna kultura rastline konoplje: Kaj je to?

• 1. Zgodovina tkivne kulture
• 2. Osnove tkivne kulture
• 3. Kaj je rastlinska tkivna kultura in kako deluje?
• 4. Tkivna kultura vs. kloniranje
• 4. a. Kloniranje
• 4. b. Tkivna kultura rastlin
• 5. Pet korakov tkivne kulture
• 5. a. Kako narediti tkivno kulturo doma
• 5. b. Smernice za kemično sestavo
• 6. Zaključek

Tkivna kultura pomeni vzeti živo tkivo iz rastline in to tkivo vzgojiti v novo rastlino v sterilnih pogojih. Ta proces izvira iz leta 1885, pri semenih konoplje je še precej nov, a zelo učinkovit, ter se lahko uporablja pri večini rastlinskih vrst. Postopek tkivne kulture omogoča stabiliziran vir rastlinskega tkiva, ki ga tehniki lahko ohranijo z množenjem rastlinskih celic. S shranjevanjem tega genskega materiala v čistih in varnih prostorih lahko ohranjajo in stalno razmnožujejo točno določene rastlinske sorte in fenotipe. Ta tehnika tako pomaga ohranjati redke rastline oziroma ohraniti produktivne in močne fenotipe žive, da jih lahko uporabimo na prostem ali v laboratoriju. Tkivno kulturo si lahko predstavljate kot “banke” genetik, ki jih hranimo v posebnih pogojih, dokler jih ne potrebujemo za presaditev v lonce ali na vrt.

1. Zgodovina tkivne kulture

Zgodovina tkivne kulture sega v leto 1885, ko je nemški zoolog poskušal gojiti tkivo iz piščančjega zarodka, a šele leta 1907 je ameriški zoolog uspešno vzgojil živčno celico žabe.

Kmalu zatem, leta 1910, je francoski kirurg to tehniko izboljšal in tudi definiral pojem tkivna kultura. Ko je bila tehnika določena in uveljavljena, so sledili številni uspešni eksperimenti, kar je drugim omogočilo gojenje matičnih celic v umetnih pogojih, kar je prineslo novo znanje o biologiji človeka in močan napredek v regenerativni medicini. Morda se sprašujete kakšna je povezava s konopljo?

2. Osnove tkivne kulture

Preden se poglobimo v tkivno kulturo, kako deluje in kakšne so razlike med tkivno kulturo in kloniranjem, poglejmo osnovne stvari o tkivni kulturi.

Raziskava

Če boste tkivno kulturo poskusili doma, najprej preverite, ali je bila že uspešno uporabljena pri določeni sorti, da boste lahko sledili ustreznemu postopku in ga uporabili kot vodič za lastno delo.

Rastlinsko tkivo

Ko veste kako ravnati, potrebujete rastlino, ki jo želite uporabiti pri postopku tkivne kulture. Donoorska rastlina mora biti 100 % zdrava in brez bolezni. Kateri del rastline uporabite, je odvisno od vrste rastline, zato vedno upoštevajte navodila. Pomembno je, da je okolje čisto, saj je kontaminacija glavni vzrok za neuspeh – očistite svoja oblačila, pripomočke in prostor.

Zrak

Nato poskrbite za čist zrak, saj rastline potrebujejo čist zrak. Za čistočo lahko uporabite improvizirano škatlo z rokavicami ali jo izdelate sami (na primer iz starega akvarija in PVC cevi).

Medij

Eden najpomembnejših delov tkivne kulture je medij, saj vanj postavite rastlino, ko dovolj zraste. Uporabite želatinasto snov, ki daje stabilnost in oporo razvoju korenin in rast rastline ter hranila za ustvarjanje energije, zato je ena izmed najbolj priljubljenih podlag Agar.

Ko veste, kaj potrebujete, berite dalje in spoznajte, kako poteka tkivna kultura pri konoplji in drugih rastlinah. Upoštevajte, da je lahko zahtevna, če nimate prave opreme, a ni nobene panike. Lahko tudi klonirate svoje rastline – število klonov je odvisno od števila vej, ki jih zraste vaša rastlina, sam postopek je veliko lažji in ne zahteva posebnih izkušenj. Potrebujete le gel za kloniranje in škarje – to je vse!

3. Kaj je rastlinska tkivna kultura in kako deluje? 

Tkivna kultura je, kot smo opisali zgoraj, preprosto vzeti nekaj rastlinskega tkiva ali celic in iz njih razviti več sto ali celo tisoč identičnih klonov. Ta metoda pridelovalcem omogoča, da izbrane strain skoraj večno ohranjajo, pri tem pa potrebujejo minimalno prostora in truda. Tako kot običajno kloniranje tudi tkivna kultura temelji na odstirku majhnega dela rastline, ki jo želite klonirati, vendar pri tkivni kulturi je ta vzorec prerezan, steriliziran in nato vložen v hranilni medij, ki ne vsebuje samo hranil, temveč tudi hormone in sladkorje.

Hranilni medij mora biti prilagojen vsaki tkivni kulturi posebej, ker bodo določena hranila in hormoni sprožili različne stopnje razvoja. Če želite spodbujati rast, razvoj korenin ali množenje rastline, boste potrebovali poseben hranilni medij za fazo, ki jo želite doseči. Tako lahko dobite več kosov tkiva, vsakega posebej razmnožujete, ko so dovolj veliki, jih hranite z medijem, ki spodbuja koreninjenje in rast.

4. Tkivna kultura vs. kloniranje

Z razvojem industrije konoplje komercialni pridelovalci iščejo najboljše načine za višje pridelke in moč v krajšem času. Kjer je mogoče, se selijo s kloniranja na tkivno kulturo – ampak zakaj?

Kloniranje 

Kot že veste, kloniranje pomeni, da iz rastline odrežete potaknjence in počakate, da razvijejo korenine, nato iz tega klona vzgojite rastlino, ki bo popolna kopija matične rastline.

A kloni so lahko nezanesljivi, podobno kot sadike, saj je težko doseči dober delež preživetja. Poleg tega so nagnjeni k škodljivcem, okužbam, boleznim, sčasoma pa lahko pride tudi do genetskih mutacij. Pri tkivni kulturi je precej drugače.

Tkivna kultura rastlin

Postopek tkivne kulture je razmeroma enostaven, vendar zahteva veliko nadzora, da zagotovimo ustrezne pogoje, laboratoriji za tkivno kulturo potrebujejo:

Sterilizacija

Pri tkivni kulturi morajo biti pogoji idealni za rast rastlin; okolje mora omogočati, da rastline prejmejo vse, kar potrebujejo, in je hkrati idealno tudi za bakterije in mikroorganizme, zato je nujna sterilizacija. Če tega ni, lahko glive ali bakterije uničijo vaše rastline, zato je treba sterilizirati ne samo laboratorij, ampak tudi orodja, opremo in rastlinsko tkivo (imenovano “eksplantat”).

Aseptično okolje  

Celoten postopek mora potekati v popolnoma sterilnem okolju, zato v idealnih razmerah pripravimo posebno komoro in se dotikamo le že sterilnih pripomočkov. To okolje se uporabi vsakič, ko izpostavimo orodje, opremo ali tkivo zraku.

Bolezni zlahka vdrejo v laboratorij; spore gliv so v zraku ves čas. Da bi preprečili okužbo rastlin v in-vitro (v posodah, kot so Petrijeve skodelice), tehniki pogosto delajo pred ali pod pretočno napo. Te naprave s pomočjo ventilatorjev preženejo zrak skozi HEPA filter—oprema, ki odstrani zelo majhne delce iz zraka, kot so virusi, bakterije in glivne spore. Tako čist zrak potuje čez delovno površino v laminarnem toku in prepreči, da bi delci padli na odprte posode.

Poseben gojitveni medij

Pri tkivni kulturi pripravimo sterilen medij, ki rastlini nudi hranila, sladkor, vodo in prostor za rast. Da rastlina preživi do trenutka, ko postane samostojna, lahko ta medij doma pripravimo iz posebnega prahu, sladkorja ter destilirane vode z pH-jem 5,8. Čeprav je postopek relativno preprost, zahteva veliko varnostnih ukrepov.

5. Pet korakov tkivne kulture

Tu so preprostih 5 korakov za rastlinsko tkivno kulturo v laboratoriju – zapomnite si, to je povzetek celotnega postopka.

1. Izberite rastlino, ki jo želite uporabiti;
2. Vstavite tkivo v sterilen prostor, izrežite kos, očistite in ga pustite rasti v ustreznem mediju;
3. Zagotovite prave pogoje in pustite tkivo, da se množi (običajno traja 14 dni);
4. Spodbudite rastlino, da naredi korenine;
5. Presadite v končno posodo in pustite, da zraste.

Če želite bolj podroben recept po korakih ter navodila za DIY, spodaj najdete vodič – vendar potrebujete tudi drago opremo, zato bo tudi domači postopek zahteval posebne pripomočke.

Kako narediti tkivno kulturo doma

Če vas zanima vodič, kako narediti tkivno kulturo s konopljo, spodaj je podroben korak po korak postopek. Kot rečeno, bo potrebna posebna oprema, a mogoče je narediti tudi doma.

Začetna faza (1-2 tedna)

Korak 1

Vklopite pretočno napo in jo pustite delovati vsaj 30 min pred začetkom; če nimate laminarnenape, uporabite plamen alkohola oziroma svetilko in delajte blizu ognja.

Korak 2

Sterilizirajte pretočno napo z 70% etanolom, vendar ne škropite neposredno na filter.

Korak 3

Vklopite sterilizator in ga ogrevajte 20 min.

Korak 4

Sterilizirajte paket papirja na suhem ciklu, nato sterilizirajte posode, vodo in tween na počasnem ciklu.

Korak 5

Za pripravo medija vzemite posodo in jo napolnite z reverzno osmozo, destilirano ali deionizirano vodo (idealno). Če pripravljate 1L medija, dodajte 900ml vode. Nato dodajte rastna hranila do EC 1,5, nato 30g/L sladkorja in prilagodite pH na 5,7. Nato dodajte 6g/L agarja, zmes vlijte v primerno steklenico (avtoklavirano, ne čez rob). Steklenico sterilizirajte 15 min in nato vlijte okoli 50 ml v vsako sterilizirano posodo.

Korak 6

Ko je medij pripravljen, pripravite raztopino z 0,5% belila in 0,1% sterilnega tweena 20. Če imate samo 2,75% belilo, dodajte 181ml na 1L vode.

Korak 7

Napolnite posodo z manjšim delom vode, vzemite material konoplje in ga postavite v vodo. Material mora biti zdrav. Če ga hranite več kot 1 uro, uporabite hladilnik z ledom in ga čimprej postavite v vodo.

Korak 8

V sterilno posodo, ki jo lahko zaprete, napolnite do 80% z belilno/tween raztopino, dodajte rastlinski material in posodo zaprite.

Korak 9

Nežno stresite 20 minut, nato močno stresite še 20 sekund po teh 20 minutah.

Korak 10

Prenesite material v novo posodo, napolnjeno z 80% sterilizirane vode, in nežno stresite 5 minut. Ponovite še dvakrat.

Korak 11

Uporabite sterilne pincete in prenesite rastlinski material na sterilni papir, da vpije odvečno vodo, potem pa postavite po en kos v vsako posodo. Rastlina mora biti v posodi pokončno, posodo nato postavite na nosilec pri 25°C in 18/6 svetlobnem ciklu za najmanj 3 tedne. Ko so vaše rastline pripravljene, ste uspešno ustvarili klon, ki je pripravljen za nadaljnjo gojenje v izbranem mediju – na prostem ali v notranjosti.

Smernice za kemično sestavo 

Vedite, da obstaja več vrst medijev. Minerali in količine se lahko razlikujejo glede na medij, ki ga uporabljate – spodnja tabela je narejena za Murashige-Skoog medij kot primer, zato vedno preverite primerno kombinacijo sestavin za vaš medij.

To so glavna hranila, ki jih rastline konoplje potrebujejo v velikih količinah in so ključna v tkivni kulturi. Če jih manjka, rastline ne bodo mogle rasti zelenih delov.

To so mikrohranila, ki jih rastline konoplje potrebujejo v manjših količinah, a so za tkivno kulturo ključna. Brez njih rast ne bo uspešna in rastline bodo pokazale znake pomanjkanja.

Ti vitamini so ključni za metabolizem rastline, posebej pri tkivni kulturi, zato poskrbite, da jih zagotovite v pravih razmerjih.

6. Zaključek

Tkivna kultura konoplje se morda zdi zahtevna, vendar je v osnovi precej enostavna – le zagotoviti morate idealne pogoje in upoštevati vsa varnostna pravila, da dosežete kar najvišjo stopnjo preživetja. Vemo, da je ta tehnika precej nova in tudi precej draga, zato si je ne bodo mogli privoščiti vsi pridelovalci, a če ste ustvarili svoj laboratorij za tkivno kulturo doma ali pa delate v znanstvenem laboratoriju, delite svoje znanje z drugimi pridelovalci – napišite komentar spodaj!

Zunanje reference

1. Plant Tissue Cultures. - Kärkönen, Anna & Santanen, Arja & Iwamoto, Kuninori & Fukuda, Hiroo. (2020). 
2. Nanotechnology and Plant Tissue Culture. - Tariq, Amina & Ilyas, Saiqa & Naz, Shagufta. (2020). 
3. Plant Tissue Culture Media, Recent Advances in Plant in vitro Culture. - Annarita Leva and Laura M. R. Rinaldi (2012).