Tkanivová kultúra rastlín konopy: Čo to je?

• 1. História tkanivovej kultúry
• 2. Základy tkanivovej kultúry
• 3. Čo je tkanivová kultúra rastlín a ako funguje?
• 4. Tkanivová kultúra vs. klonovanie
• 4. a. Klonovanie
• 4. b. Tkanivová kultúra rastlín
• 5. 5 krokov tkanivovej kultúry
• 5. a. Domáca tkanivová kultúra rastlín
• 5. b. Usmernenie pre chemické zloženie
• 6. Záver

Tkanivová kultúra spočíva v odobratí živého tkaniva z rastliny a v pestovaní tohto tkaniva do celej rastliny v sterilných podmienkach. Tento proces siaha až do roku 1885 a pri semenách konopy je pomerne nový, no veľmi účinný a dá sa využiť pri väčšine rastlinných druhov. Proces tkanivovej kultúry vedie k stabilizovanému zdroju rastlinného tkaniva, ktorý môžu technici uchovať vďaka množenie rastlinných buniek. Udržiavaním tohto germplazmy v čistých a bezpečných priestoroch môžu uchovávať a neustále rozmnožovať špecifické kultivary a fenotypy rastlín. Táto technika pomáha zachovať vzácne rastliny alebo udržať produktívne a silné fenotypy pri živote, aby mohli byť v prípade potreby nasadené do poľa. Môžete si tkanivové kultúry predstaviť ako „banky“ genetiky, ktoré sa držia v špeciálnych podmienkach až do chvíle, keď ich bude treba presadiť do nádob alebo do voľnej pôdy.

1. História tkanivovej kultúry

História tkanivovej kultúry siaha do roku 1885, kedy sa nemecký zoológ pokúsil pestovať tkanivo z kuracieho embrya, no až v roku 1907 americký zoológ úspešne vypestoval nervovú bunku žaby.

Neskôr v roku 1910 francúzsky chirurg túto techniku vylepšil a definoval, čo to tkanivová kultúra vlastne je, a potom, keď bola metóda opísaná a ustálená, nasledovalo viac úspešných pokusov, ktoré ostatným vedcom umožnili pestovať kmeňové bunky v umelých podmienkach. To viedlo k lepšiemu poznaniu ľudskej biológie a veľkému pokroku v regeneračnej medicíne. Ale možno sa teraz pýtate Aký je súvis s konopou?

2. Základy tkanivovej kultúry

Predtým než sa ponoríme do detailov, ako funguje tkanivová kultúra a aký je rozdiel medzi tkanivovou kultúrou a klonovaním, poďme si predstaviť základné informácie.

Výskum

Ak skúšate tkanivovú kultúru doma, prvý krok je zistiť, či tento postup bol úspešne aplikovaný na konkrétny strain, aby ste mohli nasledovať overený postup a možno ho použiť ako návod, čo robiť aj čo nerobiť.

Rastlinné tkanivo

Keď už viete, ako postupovať, musíte si zaobstarať rastlinu, ktorú chcete použiť na tkanivovú kultúru. Materská rastlina musí byť 100 % zdravá a bez chorôb. Záleží aj na tom, ktorú časť rastliny použijete, preto dôsledne postupujte podľa odporúčaní pre daný strain. Pamätajte, že tento proces závisí od čistého prostredia – všetko, vrátane vášho oblečenia, nástrojov a samotnej miestnosti, musí byť riadne sterilizované, pretože kontaminácia je najčastejšou príčinou neúspechu.

Vzduch

Ďalším dôležitým faktorom je vzduch, keďže rastliny potrebujú čistý vzduch. Na zabezpečenie čistého vzduchu si môžete zaobstarať jednoduchú glovebox skrinku alebo si ju vyrobiť z akváriovej nádrže a PVC trubiek, napríklad.

Médium

Jednou z najdôležitejších častí tkanivovej kultúry je médium, do ktorého sa rastlina vkladá, keď už je dosť veľká. Médium by malo byť gélovitej konzistencie, aby zabezpečilo stabilitu a podporu pre vývoj koreňov a rast rastliny, a aby poskytovalo živiny, ktoré rastlina potrebuje na rast, preto je najpopulárnejším médiom Agar.

Keď už máte lepšiu predstavu o potrebných veciach, čítajte ďalej, aby ste pochopili, ako sa robí tkanivová kultúra u konopy a iných rastlín. Pamätajte, že tkanivová kultúra môže byť zložitá, ak nemáte správny materiál a vybavenie, no nemusíte sa obávať. Stále môžete svoje rastliny jednoducho klonovať; aj keď počet klonov závisí od počtu vetiev, ktoré rastlina vypestuje, je to oveľa jednoduchšie a nevyžaduje príliš veľa skúseností. Stačí vám klonovací gél a nožnice, a to je všetko!

3. Čo je tkanivová kultúra rastlín a ako funguje? 

Tkanivová kultúra je presne to, čo bolo vyššie vysvetlené: získavanie len niekoľkých kúskov rastlinného tkaniva alebo buniek a vypestovanie stoviek až tisícov identických klonov. Táto metóda umožňuje pestovateľom uchovať vybraný strain prakticky naveky, pričom stačí minimum priestoru a úsilia. Pri bežnom klonovaní je potrebné vyrezať väčšiu časť rastliny, ale pri tkanivovej kultúre sa malá vzorka tkaniva zostrihá, sterilizuje a po vyčistení sa vloží do kultúry s výživnými látkami, ktorá obsahuje nielen živiny, ale aj hormóny a cukry.

Táto výživová kultúra je prispôsobená pre každý tkanivový vzorok, pretože niektoré živiny a hormóny vyvolávajú určité štádiá vývoja. Ak chcete podporiť rast, vývoj koreňov alebo množenie (keď je rastlina dosť veľká), musíte zabezpečiť špecifický výživový roztok na požadovaný vývin. Teda vezmete kúsok tkaniva, a keď už je dostatočne veľké, môžete ho rozdeliť na stovky častí a klonovať samostatne. Keď budú tkanivá pripravené na rast, nasadia sa do média, ktoré ich podporí v korenení a raste.

4. Tkanivová kultúra vs. klonovanie

Ako sa konopný priemysel rozvíja, komerční pestovatelia hľadajú spôsoby, ako dosiahnuť vyššiu úrodu a silu v kratšom čase. Kde je to možné, pestovatelia prechádzajú od klonovania k tkanivovej kultúre – ale prečo?

Klonovanie 

Ako už viete, klonovanie je odoberanie odrezkov z rastliny a čakanie na zakorenenie, aby mohla rásť – tento klon sa stane presnou kópiou materskej rastliny.

Kliny môžu byť však ako sadenice nespoľahlivé, je ťažké zabezpečiť vysokú mieru prežitia a navyše sú náchylné na škodce, infekcie, choroby, a čím viac generácií, tým viac genetických mutácií. Pri tkanivovej kultúre je to iné.

Tkanivová kultúra rastlín

Proces tkanivovej kultúry je relatívne jednoduchý, no vyžaduje veľkú kontrolu, aby boli zachované správne podmienky. Laboratóriá na tkanivovú kultúru vyžadujú:

Sterilizácia

Tkanivové kultúry si vyžadujú ideálne prostredie pre rast – musí zabezpečiť všetko, čo rastlina potrebuje v ľahko vstrebateľnej forme. Takéto prostredie je však ideálne aj pre baktérie a škodlivé mikroorganizmy, preto musí byť všetko sterilizované. Táto sterilizácia je kľúčová – plesne alebo baktérie môžu rastliny ľahko zahubiť, preto sa musí sterilizovať nielen laboratórium, ale aj všetky nástroje a samotné tkanivo („explantát“).

Aseptické prostredie  

Celý proces musí prebiehať v absolútnej sterilite. Ideálne sa vytvára špeciálna komora, kde môžete manipulovať s už sterilnými pomôckami. Takéto prostredie sa používa vždy, keď potrebujete vystaviť vzduchu nástroje, výbavu alebo tkanivo.

Choroby sa do pracovného priestoru dostanú veľmi ľahko – spóry plesní sú všade vo vzduchu. Na zabránenie kontaminácie in vitro rastlín (tých, čo rastú vo fľaši, napr. v Petriho miskách) technici často pracujú pred alebo pod laminárnym sterilizačným boxom. Tieto zariadenia fúkajú vzduch cez HEPA filter—pomôcka, ktorá zadrží aj veľmi malé znečisťujúce častice, napríklad vírusy, baktérie či plesne. Čistý vzduch potom prúdi cez pracovnú zónu a zabraňuje, aby sa nečistoty usadzovali na otvorených miskách.

Špeciálne pestovacie médium

Pri tkanivovej kultúre sa pripravuje sterilné médium s živinami, cukrom, vodou a miestom na rast, ktoré dá rastline všetko, čo potrebuje do momentu, kým nebude celá rastlina. Doma sa to dá pripraviť z hotového prášku, cukru a destilovanej vody upravenej na pH 5,8 – aj keď je to jednoduché, vyžaduje to veľa bezpečnostných opatrení.

5. 5 krokov tkanivovej kultúry

Tu je 5 jednoduchých krokov tkanivovej kultúry rastlín v laboratóriu, ide len o stručné zhrnutie celého procesu.

1. Vyberte rastlinu, ktorú chcete použiť;
2. Vložte tkanivo do sterilného prostredia, odoberte kúsok, vyčistite ho a nechajte rásť vo vhodnom médiu;
3. Zabezpečte správne podmienky a nechajte tkanivo množiť (zvyčajne 14 dní);
4. Podporte zakorenenie rastliny;
5. Presuňte do konečnej nádoby a nechajte rásť.

Ak chcete podrobný návod krok za krokom na domáce spracovanie, tu je sprievodca – počítajte však s tým, že budete potrebovať drahé náradie, takže aj keď ide o DIY, potrebné je špeciálne vybavenie.

Domáca tkanivová kultúra rastlín

Ak vás zaujíma, ako robiť tkanivovú kultúru s konopou doma, tu je podrobný postup krok za krokom. Ako už bolo povedané vyššie, budete potrebovať špeciálne vybavenie, ale je to úplne možné.

Vstupná fáza (1–2 týždne)

Krok 1

Zapnite laminárny box minimálne na 30 minút pred začatím práce. Ak ho nemáte, použite liehový kahan či lampu a pracujte v blízkosti plameňa.

Krok 2

Sterilizujte box s 70% etanolom, ale nestriekajte priamo na filter.

Krok 3

Zapnite sterilizátor a nechajte ho nahriať 20 minút.

Krok 4

Sterilizujte balík papiera na suchom cykle, potom sterilizujte nádoby, vodu a tween na pomalšom cykle.

Krok 5

Na prípravu média použite nádobu, naplňte ju reverznou osmózou, destilovanou alebo deionizovanou vodou (ideálne). Ak pripravujete 1L média, pridajte 900 ml vody. Následne pridajte rastové živiny až na EC 1,5, potom 30 g/l cukru a upravte pH na 5,7. Nakoniec pridajte 6 g/l agaru a nalejte do autoklávovateľnej fľaše, neprepĺňajte. Sterilizujte fľašu 15 minút a potom do každej sterilizovanej nádoby nalejte asi 50 ml.

Krok 6

Keď je médium pripravené, pripravte si roztok z 0,5% bielidla a 0,1% sterilného tweenu 20, ak máte len 2,75% bielidlo, pridajte 181 ml na 1 l.

Krok 7

Naplňte nádobu trochou vody, vložte do nej konopný materiál a uistite sa, že je zdravý. Ak ho skladujete dlhšie ako 1 hodinu, dajte ho do chladiaceho boxu s ľadom a snažte sa ho čo najskôr ponoriť do vody.

Krok 8

Pripravte si uzatvárateľnú sterilnú nádobu, naplňte ju na 80% roztokom bielidla/tweenu, pridajte rastlinný materiál a uzavrite.

Krok 9

Jemne pretrepte 20 minút a potom silno pretrepte 20 sekúnd po úvodných 20 minútach.

Krok 10

Materiál preložte do druhej nádoby so sterilizovanou vodou (80 %) a jemne pretrepte 5 minút, opakujte ešte 2x.

Krok 11

Pomocou sterilných pinziet preneste rastlinný materiál na sterilný papier, ktorý nasaje prebytočnú vodu, potom vložte jeden kus rastlinného tkaniva do každej nádoby. Rastlina má byť vo vzpriamenej polohe v nádobe a skúmavky umiestnite na stojan pri 25 °C pod 18/6 svetelným cyklom aspoň 3 týždne. Po dokončení budete mať úspešne vypestovaný klon pripravený na rast v akomkoľvek médiu, či už outdoor alebo indoor.

Usmernenie pre chemické zloženie 

Majte na pamäti, že existujú rozličné typy médií, minerály a ich množstvá sa menia podľa typu média. Tento návod používa ako príklad médium Murashige-Skoog, preto si vždy overte zloženie a množstvá pre vaše konkrétne médium.

Toto sú základné makroživiny, ktoré vaše rastliny konopy potrebujú vo vyššom množstve a sú nevyhnutné aj pri tkanivovej kultúre – bez nich rastliny nevytvoria zelenú hmotu.

Tieto mikroživiny vaše rastliny konopy potrebujú v menšom množstve, ale rovnako sú kľúčové v tkanivovej kultúre – ich nedostatok spôsobí poruchy rastu.

Tieto vitamíny sú kľúčové pre metabolizmus rastlín, najmä v tkanivovej kultúre, preto ich zabezpečte v správnych množstvách.

6. Záver

Tkanivová kultúra konopy sa môže zdať zložitá, ale v skutočnosti je pomerne jednoduchá – stačí dodržiavať správne podmienky a bezpečnostné zásady, aby bola úspešnosť čo najvyššia. Je nám jasné, že táto technika je nová a môže byť drahá, takže nie každý pestovateľ má k dispozícii potrebné vybavenie, no ak pracujete alebo ste si doma zriadili vlastné laboratórium tkanivovej kultúry, podeľte sa o svoje poznatky s ostatnými pestovateľmi – napíšte komentár pod článok!

Externé zdroje

1. Tkanivové kultúry rastlín. - Kärkönnen, Anna & Santanen, Arja & Iwamoto, Kuninori & Fukuda, Hiroo. (2020). 
2. Nanotechnológia a tkanivová kultúra rastlín. - Tariq, Amina & Ilyas, Saiqa & Naz, Shagufta. (2020). 
3. Tkanivová kultúra rastlín – médiá, nové poznatky v in vitro kultúre rastlín. - Annarita Leva a Laura M. R. Rinaldi (2012).