Kultura biljnih tkiva kanabisa: Šta je to?

• 1. Istorija kulture biljnih tkiva
• 2. Osnovi kulture biljnih tkiva
• 3. Šta je kultura biljnih tkiva i kako funkcioniše?
• 4. Kultura tkiva vs kloniranje
• 4. a. Kloniranje
• 4. b. Kultura biljnih tkiva
• 5. 5 koraka kulture tkiva
• 5. a. Kako raditi kulturu biljnih tkiva kod kuće
• 5. b. Vodič za hemijski sastav
• 6. Zaključak

Kultura tkiva podrazumeva uzimanje živog tkiva sa biljke i uzgajanje tog tkiva u celu biljku u sterilnim uslovima. Ovaj proces datira još iz 1885. godine i relativno je nov kada su u pitanju semena kanabisa, ali je izuzetno efikasan i može se koristiti kod većine biljnih vrsta. Proces kulture tkiva rezultira stabilizovanim izvorom biljnog tkiva koji tehničari mogu sačuvati kroz umnožavanje biljnih ćelija. Držanjem ovog biljnog materijala (germplazme) u čistim i sigurnim prostorijama, omogućava se očuvanje i neprekidno razmnožavanje određenih genetskih varijeteta biljaka i fenotipova. Ova tehnika konačno pomaže u očuvanju retkih biljaka, ili održavanju produktivnih i potentnih fenotipova koji mogu ponovo biti korišćeni na terenu kada se umnože. Kulture tkiva možete posmatrati kao „banke“ genetike koje se čuvaju pod posebnim uslovima dok ne dođe vreme za presađivanje u saksije ili na otvoreno.

1. Istorija kulture biljnih tkiva

Istorija kulture tkiva datira još iz 1885. godine kada je nemački zoolog pokušao da uzgoji tkivo iz embriona pilića, ali tek 1907. godine američki zoolog je uspešno uzgojio nervnu ćeliju žabe.

Kasnije, 1910. godine francuski hirurg je usavršio ovu tehniku i dao definiciju kulture tkiva, a pošto je tehnika definisana i uspostavljena, nekoliko drugih eksperimenata je bilo uspešno i omogućilo drugim istraživačima da uzgajaju matične ćelije pod veštačkim uslovima, što je dovelo do napretka u znanju o ljudskoj biologiji i velikog progresa u regenerativnoj medicini. Ali, verovatno se pitate kakve to veze ima sa kanabisom?

2. Osnovi kulture biljnih tkiva

Pre nego što uđemo dublje u kulturu tkiva, kako funkcioniše i razlike između kulture tkiva i kloniranja, hajde da naučimo osnove ove tehnike.

Istraživanje

Ako kod kuće pokušavate kulturu tkiva, prvo što treba da uradite je da istražite da li je postupak uspešno primenjen kod određene sorte, kako biste mogli da sledite isti postupak ili eventualno iskoristite ga kao smernicu da znate šta da uradite, a šta ne.

Biljno tkivo

Kada znate šta treba raditi, sledeći korak je da nabavite biljku koju želite iskoristiti za proces kulture tkiva. Biljka donator mora biti 100% zdrava i bez bolesti. Takođe, deo biljke koji se koristi zavisi od vrste biljke, pa strogo sledite prethodno pomenute smernice kako biste povećali šansu za uspeh. Imajte na umu da ovaj proces zahteva čistu sredinu, pa sve treba biti dezinfikovano - vaša odeća, materijal, prostorija, jer je kontaminacija glavni uzrok neuspeha.

Vazduh

Sledeći element je vazduh, pošto je biljkama potreban čist vazduh. Da biste to obezbedili, možete kupiti gotovu "glove box" kutiju ili napraviti svoju korišćenjem stare akvarijumske posude i PVC cevi, na primer.

Medijum

Jedan od najvažnijih delova kulture tkiva je medijum, pošto će se biljka postavljati na njega kada dovoljno naraste. Medijum treba da bude želatinasta supstanca koja obezbeđuje stabilnost i podršku za razvoj korena i rast biljke, kao i hranljive materije koje biljci daju energiju za rast. Zato je jedan od najčešćih medijuma Agar.

Sad kad znate šta vam sve treba, nastavite sa čitanjem kako biste saznali kako primeniti kulturu tkiva na kanabis i ostale biljke. Zapamtite, kultura tkiva može biti zahtevna bez odgovarajuće opreme i materijala ali nema potrebe za brigom - uvek možete klonirati svoje biljke; iako broj klonova zavisi od broja izdanaka vaše biljke, kloniranje je daleko lakše i ne zahteva mnogo iskustva. Sve što vam treba jesu gel za kloniranje i makaze, i to je to!

3. Šta je kultura biljnih tkiva i kako funkcioniše? 

Kultura tkiva je upravo ono što je gore objašnjeno, dakle, uzimate samo nekoliko komadića biljnog tkiva ili ćelija i razvijate stotine ili čak hiljade identičnih klonova; ova metoda omogućava uzgajivačima da sačuvaju određenu sortu gotovo zauvek, uz minimalan prostor i trud. Kao i kod običnog kloniranja, kultura tkiva počinje malim delom biljke koju želite da klonirate, ali za razliku od običnog kloniranja, uzorak tkiva se sređuje, sterilizuje i nakon toga stavlja u hranljivi medijum koji sadrži ne samo hranljive materije, već i hormone i šećere.

Hranljivi medijum je kreiran za svaku kulturu tkiva posebno, jer pojedini nutrijenti i hormoni pokreću određene faze razvoja, pa ukoliko želite da podstaknete rast, razvoj korena i/ili umnožavanje (kada biljka dovoljno naraste), morate obezbediti odgovarajući sastav medijuma za željeni razvoj. Dakle, uzimate deo tkiva i, kada dovoljno naraste, možete ga iseći na stotine delova i svakog klonirati posebno, ako to želite. Kada tkiva budu dovoljno velika za rast, daju im se hranljivi medijumi koji ih podstiču na ukorenjavanje i potom rast.

4. Kultura tkiva vs Kloniranje

Kako industrija kanabisa napreduje, komercijalni uzgajivači traže najbolji način da dobiju više prinosa i jaču snagu za manje vremena. Kad god je moguće, bira se prelazak sa kloniranja na kulturu tkiva, ali zašto?

Kloniranje 

Kao što već verovatno znate, kloniranje podrazumeva uzimanje reznica sa biljke i čekanje da razviju koren kako bi mogle da se uzgajaju - ovaj klon biće identična kopija svoje matične biljke.

Ali klonovi mogu biti nepouzdani kao i semena, jer je teško ostvariti dobru stopu preživljavanja, i pored toga, podložni su štetočinama, infekcijama, bolestima, a tokom više generacija lako može da dođe do mutacija. Sa kulturom tkiva stvari su dosta drugačije.

Kultura biljnih tkiva

Proces kulture tkiva je relativno jednostavan, ali zahteva visok nivo kontrole da bi se održali idealni uslovi. Laboratorije za kulturu tkiva moraju imati:

Sterilizacija

Kulture tkiva zahtevaju idealno okruženje za rast biljaka; to okruženje biljci daje sve potrebne elemente u lakoj formi za apsorpciju, ali je istovremeno pogodno i za rast bakterija i štetnih mikroorganizama, pa sve mora biti sterilizovano. Sterilizacija je ključna jer pečurke ili bakterije mogu uništiti vaše biljke, tako da ne sme biti sterilizovana samo laboratorija, već i alati, oprema, ali i samo biljno tkivo (zvani „eksplant“).

Aseptički uslovi  

Neophodno je ceo proces izvoditi u potpuno sterilnoj sredini, pa je u idealnim uslovima posebna komora izrađena da bi mogli da radite sa sterilnom opremom. Ovo posebno okruženje koristi se pri svakom izlaganju vazduhu bilo kog alata, opreme ili tkiva.

Bolesti lako ulaze u radne prostore; spore pečuraka su stalno prisutne u vazduhu oko nas. Da bi se izbegla kontaminacija in vitro biljaka (onih koje rastu u staklenim posudama poput Petri šolja), tehničari često rade ispred ili ispod poklopca sa laminarnim protokom. Ovi uređaji koriste ventilatore koji duvaju vazduh kroz HEPA filter—oprema koja uklanja veoma male zagađivače iz vazduha, poput virusa, bakterija, spora pečuraka. Čist vazduh zatim prelazi preko radne površine, sprečavajući padanje čestica na otvorene Petri šolje.

Poseban medijum za rast

Kod kulture bilјnih tkiva, sterilni medijum daje biljci nutrijente, šećer, vodu i mesto za rast; ovaj medijum nudi sve što je potrebno da bi biljka preživela dok ne postane potpuno formirana. Može se napraviti i kod kuće iz gotovog praha, šećera i destilovane vode, pH podešen na 5.8, pa iako je relativno jednostavno, zahteva mnogo mera bezbednosti.

5. 5 koraka kulture tkiva

Ovo su 5 jednostavnih koraka kulture biljnih tkiva u laboratoriji, imajte u vidu da je ovo samo skraćen pregled celog procesa.

1. Izaberite biljku koju želite da koristite;
2. Stavite tkivo u sterilan prostor, odvojite deo, očistite ga i ostavite da raste u odgovarajućem medijumu;
3. Obezbedite odgovarajuće uslove i pustite da se tkivo umnožava (uglavnom traje 14 dana);
4. Podstaknite ukorenjavanje biljke;
5. Presađivanje u saksiju i dalji rast.

Ako želite detaljan vodič korak po korak kako se to radi kod kuće, evo vodiča, ali imajte u vidu da su potrebni skupi alati čak i kada sami pravite laboratoriju.

Kako raditi kulturu biljnih tkiva kod kuće

Ako vas zanima vodič kako da radite kulturu biljnih tkiva sa kanabisom, evo detaljnog vodiča korak po korak, kao što je gore rečeno, potrebno je specijalizovano opremanje ali sasvim je moguće izvesti i kod kuće.

Faza inicijacije (1-2 nedelje)

Korak 1

Uključite laminarni protok (flow hood) i ostavite da radi najmanje 30min pre početka. Ako nemate laminarni protok, koristite alkoholnu lampu i radite neposredno pored plamena.

Korak 2

Sterilišite radni prostor sa 70% etanolom ali ne prskajte direktno na filter.

Korak 3

Uključite sterilizator i ostavite da se zagreje 20min.

Korak 4

Sterilišite paket papira na suvom ciklusu, a zatim sterilišite posude, vodu i tween na sporom ciklusu.

Korak 5

Zatim za pripremu medijuma, uzmite posudu, napunite je reverzno osmotskom, destilovanom ili dejonizovanom vodom (idealno). Ako pripremate 1L medijuma, dodajte 900ml vode. Kada voda bude spremna, dodajte Grow hraniva dok EC ne dostigne 1.5, nakon toga dodajte 30g/L šećera i podesite pH rastvora na 5.7, pa dodajte 6g/L agara i sipajte sve u flašu za autoklaviranje, ali nemojte prelivati. Sterilišite flašu 15 minuta pa sipajte po 50ml u svaku sterilisanu posudu koju ćete koristiti.

Korak 6

Kada ste pripremili medijum, napravite rastvor sa 0.5% izbeljivača i 0.1% sterilnog tweena 20, ako imate samo 2.75% izbeljivača, dodajte 181ml na 1L.

Korak 7

Napravite posudu sa malo vode, uzmite bilјni materijal kanabisa i stavite ga u vodu, proverite da li je materijal zdrav. Ako skladištite materijal duže od 1 sat, stavite ga u rashladnu kutiju sa ledom i pokušajte da ga što pre uronite u vodu.

Korak 8

Uzmite zatvorivu sterilisanu posudu i napunite je oko 80% rastvorom izbeljivača i tweena, zatim stavite biljni materijal i zatvorite.

Korak 9

Lagano mućkajte 20 minuta, a zatim snažno mućkajte 20 sekundi nakon prvih 20 minuta.

Korak 10

Prenesite biljni materijal u drugu posudu napunjenu sa 80% sterilizovane vode, lagano mućkajte 5 minuta i ponovite još 2 puta.

Korak 11

Koristite sterilne pincete da prebacite biljni materijal na sterilnu salvetu radi upijanja viška vode, zatim stavite po jedan uzorak materijala u svaku posudu. Biljka treba da stoji uspravno u posudi i stavlja se na policu na 25°C ispod 18/6 svetlosnog režima najmanje 3 nedelje. Kada budu spremne, uspešno ste uzgojili klon i sada ga možete uzgajati na otvorenom ili u zatvorenom.

Vodič za hemijski sastav 

Imajte u vidu da postoje različite vrste medijuma, minerali i količine se razlikuju u zavisnosti od tipa medijuma. Ovaj vodič je pisan korišćenjem Murashige-Skoog medijuma kao primera, pa proverite koje sastojke i količine preferira medijum koji koristite.

Ovo su esencijalni nutrijenti koje vaše biljke kanabisa treba da primaju u velikim količinama i ključni su za kulturu tkiva; bez njih biljke neće biti u stanju da razviju zelenu masu.

Ovo su nutrijenti koje biljke kanabisa treba da primaju u manjim količinama ali su takođe neophodni za kulturu tkiva; bez njih, biljke ne mogu normalno napredovati i sigurno će pokazati simptome deficita.

Ovi vitamini su ključni za podršku metabolizmu vaše biljke, posebno kod kulture tkiva, pa ih obavezno obezbedite, i to u odgovarajućim količinama.

6. Zaključak

Kultura tkiva kanabisa može izgledati zahtevno, ali je relativno jednostavna - potrebno je samo da obezbedite najbolje moguće uslove i preduzmete sve bezbednosne mere kako biste ostvarili što veću stopu preživljavanja. Znamo da je ova tehnika još uvek nova i ume da bude skupa, pa je ne mogu svi uzgajivači priuštiti potrebnu opremu, ali ako radite ili ste napravili svoju laboratoriju za kulturu tkiva kod kuće, podelite svoja iskustva sa drugim uzgajivačima i ostavite komentar ispod!

Eksterni izvori

1. Plant Tissue Cultures. - Kärkönen, Anna & Santanen, Arja & Iwamoto, Kuninori & Fukuda, Hiroo. (2020). 
2. Nanotechnology and Plant Tissue Culture. - Tariq, Amina & Ilyas, Saiqa & Naz, Shagufta. (2020). 
3. Plant Tissue Culture Media, Recent Advances in Plant in vitro Culture. - Annarita Leva and Laura M. R. Rinaldi (2012).